Серологические методы

В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов в  организме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum - сыворотка, жидкая  составная часть крови) - это раздел иммунологии, изучающий реакции  антигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Они  связываются с определенными  антигенными веществами, находящимися на поверхности  вирусных частиц. В результате связывания молекул  антител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса  . Ее можно  проводить как на животных, так и  на культуре клеток.

Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы  нейтрализовать вирус, не дать ему проявить  цитопатическое действие, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек.

Для обнаружения антител используется метод  торможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследовательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусологический материал подготавливается для физических и химических анализов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти анализы требуют большого количества  совершенно чистого вируса. Очистка вируса - процесс, при котором из суспензии с  вирусом устраняются все  посторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и «обломки»  клеток - хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение суспензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материал для многих исследований.

Из отдельных методов очистки  упомянем лишь наиболее эффективный - метод ультрацентрифугирования,  который дает препараты вируса очень высокой концентрации.

Опишем вкратце процедуру  получения и очистки вирусной суспензии. Процесс этот начинается с  искусственного введения вируса в мозг подопытного животного. По прошествии нескольких дней вирус размножится в ткани мозга. При этом обнаружатся  характерные нарушения функций  нервной системы «хозяина», и у животного выявятся признаки заболевания. Когда симптомы достигнут наибольшего развития, зверька умерщвляют, а его мозг, в  тканях которого содержатся большие количества вируса, извлекают в стерильных условиях из черепа  животного. Затем из мозга готовится, скажем ,10 %-ная суспензия. Кроме вирионов она содержит еще и большое количество кусочков нервной ткани, остатки кровеносных сосудов, кровяные тельца и другие биологические компоненты. Кусочки ткани и другие крупные частицы устраняются первым центрифугированием со скоростью 5000-10000 оборотов в минуту. Оно продолжается около получаса. Жидкость над осадком (суперкатакт) осторожно сливают  в специальные пробирки для центрифугирования, сделанные из пластмассы или нержавеющей стали, поскольку стекло не выдерживает давление, которое развивается при  высокоскоростном центрифугировании. А осадок обезвреживают дезинфицирующими средствами. Слитый «супернатант» обрабатывается затем уже в ультрацентрифуге.

Для седиментации мельчайших вирусов необходимо многочасовое ультрацентрифугирование, причем полученный осадок часто бывает не больше булавочной головки. Но и  после такой обработки мы имеем не совсем чистый вирусный материал, в нем еще содержатся чужеродные примеси. Для тонких анализов этот осадок надо несколько раз обработать различными  реактивами и повторить  ультрацентрифугирование. Только тогда можно получить  концентрированную суспензию вируса высокой чистоты, которая требуется для точных и достоверных биохимических, кристаллографических анализов или для  наблюдений в электронно-оптических приборах.

В распоряжении вирусологов вообще много различных технических приспособлений, как , например ,  центрифугирование по градиентам концентрации, когда вирионы разделяются по степеням концентрации или по форме. Другой прибор, представляющий в наше время  стандартное оборудование почти каждой научно-исследовательской  вирусологической лаборатории - электронный микроскоп. Это дорогостоящий, большой и сложный аппарат.

Для получения изображения вирусов существует много различных методов, и все они прошли свои этапы развития. Чтобы  обнаружить вирионы в клетках, в настоящее время пользуются методом  ультратонких срезов  Фиксированный материал, залитый эпоксидной смолой, разрезается  тончайшим стеклянным или алмазным ножом. При помощи точных ультрамикротомов  одну клетку можно разрезать более чем на тысячу тонких срезов. Полученные таким образом срезы обрабатываются затем специальными химикалиями, что обеспечивает лучшую их видимость.

Для наблюдения тонкого строения отдельных вирионов применяется метод негативного контрастирования (окрашивания), внедрение которого значительно повысило качественный уровень электронного  микроскопирования. Вирусные частицы при этом осторожно смешиваются с  раствором фосфовольфрамовой  кислоты, дающей осадок, не пропускающий электронные лучи. В результате вирионы предстают в виде своих совершенно точных отпечатков, по которым можно изучать самые тонкие детали их поверхностей. При методе  позитивного  окрашивания (или «металлизирования» препарата) применяются такие вещества, которые способны выборочно прилипать к поверхности  вирионов (например, специфические антитела, меченные ферритином, содержащим в своей молекуле железо и потому хорошо  различимые в электронном микроскопе).