Определение специфических олигонуклеотидных последовательностей

б. Определение специфических олигонуклеотидных последовательностей лишено недостатков описанного выше метода. Аллели генов HLA иногда отличаются друг от друга лишь по одной паре нуклеотидов. Синтезированы одноцепочечные олигонуклеотидные зонды, состоящие из 19-24 нуклеотидов, полностью комплементарные уникальным последовательностям каждого известного аллеля гена HLA. Созданы также зонды, комплементарные общим для нескольких аллелей последовательностям. Таким образом, для определения неизвестного аллеля можно последовательно использовать серию зондов разной специфичности. Для гибридизации с олигонуклеотидными зондами можно использовать как рестрикционные фрагменты ДНК, полученные с помощью эндонуклеаз, так и фрагменты ДНК, полученные с помощью ПЦР.

в. ПЦР - метод, предназначенный для получения большого количества копий фрагментов ДНК с определенной нуклеотидной последовательностью. Основное достоинство метода - высокая чувствительность, он позволяет создать множество копий фрагмента ДНК при минимальном исходном ее количестве. Для проведения ПЦР необходимо синтезировать два олигонуклеотида, комплементарных 5'-концевым участкам цепей исследуемого фрагмента ДНК. Реакция включает следующие стадии: 1) денатурация ДНК с получением двух однонитевых фрагментов; 2) гибридизация олигонуклеотидов с 5'-концевыми участками этих фрагментов; 3) синтез комплементарной последовательности нуклеотидов. Реакцию проводят циклично, последовательно повторяя все ее стадии до получения достаточного количества копий исходного фрагмента ДНК. Количество копий ДНК увеличивается экспоненциально и после 20-го цикла реакции возрастает более чем в 1 000 000 раз. Полученные копии исследуют с помощью набора олигонуклеотидных зондов. Гибридизация зонда, который кодирует последовательность известного аллеля гена HLA, с исследуемым фрагментом ДНК свидетельствует о том, что в геноме исследуемого содержится данный аллель. Если гибридизации не происходит, данный аллель отсутствует. Отсутствие гибридизации со всеми олигонуклеотидными зондами не служит доказательством открытия нового аллеля, поскольку может быть обусловлен неполнотой использованного набора зондов. Разрабатывается молекулярно-генетическое типирование генов HLA класса I. Высокая точность и специфичность ПЦР позволяет с успехом использовать этот метод в других областях медицины, например в судебно-медицинской экспертизе. Разрабатываются и другие молекулярно-генетические методы типирования HLA.