Методы определения активности протеолитических ферментов

Модификационный метод. Модификационный метод с применением субстрата казеина основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических фермен-тов, содержащихся в материале, взятом на анализ. Скорость реакции определяют по количеству образовав-шихся аминокислот - тирозина (-амино--оксифенилпропионовая кислота) и триптофана (-амино--индолилпропионовая кислота), которые устанавливают колориметрической реакцией с реактивом Фолина. Этим методом определяют указанные аминокислоты как в сво-бодном, так и в связанном состоянии.
По количеству тирозина и триптофана, содержаще-муся в гидролизате, определяют количество превращен-ного белка в процессе ферментативной реакции (из расчета содержания в белке 6% тирозина и 1.8% трип-тофана). В основу расчета активности протеолитиче-ских ферментов положена зависимость степени гидроли-за белка от числа единиц активности фермента, вве-денных в ферментативную реакцию. На основе этой зависимости составляется график.
Поскольку в данном методе количество аминокис-лот, характеризующих количество превращаемого белка, определяется по интенсивности окраски реакционных сред - оптической плотности после реакции с реакти-вом, то в графике для простоты расчета вместо коли-чества превращенного белка ставится пропорциональная ему оптическая плотность раствора. При составлении графика по оси абсцисс откладывают число единиц фер-мента, введенное в ферментативную реакцию, а по оси ординат - оптическую плотность, полученную после ко-лориметрической реакции с реактивом Фолина.

Содержание белка,мг Единицы активности

Зависимость оптической плотности от количества превращенного в процессе ферментативной реакции белка.

Зависимость оптической плотности от числа единиц активности протеолитиче-ских ферментов.

Относя количество введенных в реакцию единиц активности фермента к действию 1 г препарата, опре-деляют его активность. Для расчета прямой, изобра-женной на графике, составляет расчетное уравнение.
За единицу протеолитической активности принято такое количество фермента, которое катализирует за 30 минут гидролиз 1 г белка в принятых условиях до продуктов, не осаждающихся трихлоруксусной кислотой. 1г составляет 25% от взятого на ферментативную реак-цию белка.
Протеолитическая активность характеризуется числом единиц активности фермента, содержащегося в 1 г препарата и твердых полупродуктов или в 100 мл жидких материалов. Метод предназначен для анализа очищенных ферментных препаратов грибного происхожде-ния и всех полупродуктов, получающихся при их произ-водстве.
Определение пепсина по Ансону и Мирскому. Дан-ный метод основан на следующих принципах. Гемоглобин подвергают воздействию пепсина, оставшийся гемогло-бин осаждают трихлоруксусной кислотой. Фенольные свойства остатка (тирозин), определяемые фотометри-чески, используют как меру активности фермента.
Субстратом служит 2%-ный раствор гемоглобина в 0.06 н. растворе соляной кислоты, 5 мл субстрата на-гревают до 250С, прибавляют 1 мл раствора фермента, оставляют в течении 10 мин., добавляют 10 мл 0.3 н. раствора трихлоруксусной кислоты, энергично взбалты-вают, фильтруют и 5 мл фильтрата отливают в мерную колбу на 25 мл. Сюда же приливают 10 мл 0.5 н. рас-твора едкого натра и 3 мл фенольного реактива (реак-тив Фолина-Чиокалтеу разводят предварительно двойным объемом воды) и доводят водой до метки. По истечении нескольких минут окрашенный раствор фотометрируют относительно стандартного раствора, содержащего 0.0008 мэкв тирозина в 5 мл 0.2 н. раствора соляной кислоты (к раствору добавляют 0.5% формальдегида в качестве антисептика). Для исключения возможных оши-бок ставят холостой опыт. Единицы пепсина выражают в миллиэквивалентах тирозина (в пределах от 6.10-4 до 11.10-4): единицы пепсина = миллиэквиваленты тирозина х1.47.
Определение протеолитических ферментов по Муру и Штейну. Метод основан на том, что содержащие -аминогруппу аминокислоты дают с нингидридом окрашен-ную производную - дикетогидриндилидендикетогидринда-мин, а также альдегид-аминокислоты и углекислоту.
Окрашенный продукт обладает характерным макси-мумом поглощения при 570 м, а интенсивность окраски зависит от количества аминокислоты. С пролином и ок-сипиролином реакция протекает в ином направлении, а максимум поглощения получаемого при этом окрашенного продукта расположен при 440 м.
Инкубацию фермента удобно проводить в мерных колбочках по 5 мл, в которых смешивают и уравновеши-вают при постоянной температуре на водяной бане все компоненты за исключением фермента. После этого до-бавляют фермент, раствор смешивают и берут пробы для исследования. Для кинетических измерений концентра-цию фермента желательно подобрать таким образом, чтобы аликвотные части можно было бы брать каждые 5 минут.
Аликвотные части пробы, взятые сразу же после добавления фермента, а затем через соответствующие интервалы, добавляют в фотометрические пробирки, со-держащие 2 мл реактива нингидрида - это тотчас обры-вает реакцию. После этого смесь 20 мин. нагревают на водяной бане; полученная окраска устойчива минимум 24 часа. Средняя ошибка при анализе повторных проб составляет 2%. После разбавления кипяченой смеси пробы и нингидрида 10 мл смеси, состоящей из равных объемов воды и н.пропанола, интенсивность окраски определяют на спектрофотометре Колемана при 570 м.
Для калибровки пользуются постоянными количест-вами стандартных аминокислот, содержащих реакционные компоненты. При помощи калибровочных кривых, постро-енных отдельно для каждой исследуемой аминокислоты, измерения интенсивности окраски (по отношению к кон-трольной колбе) пересчитывают в миллимоли. При деле-нии этих величин на миллимоли субстрата, использо-ванного в процессе реакции, можно найти процент гид-ролиза.
Построение калибровочной кривой исключает ошиб-ки, происходящие от качественных различий реакции аминокислот на цветной реактив. До оптической плот-ности 0.1 зависимость между величиной поглощения и количеством субстрата носит линейный характер.
Воспроизводимость составляет 3%. Мешающее влия-ние аммония, аминов и других веществ, содержащихся в биологическом материале и дающих цветную реакцию с нингидридом, исключается при помощи соответствующих холостых проб. Анализ сравнительно упрощается, когда изучают протеолитические ферменты, субстратами кото-рых являются пептиды, не содержащие свободных ами-ногрупп. В этом случае вся образующаяся окраска це-ликом приходится на освободившуюся аминокислоту.
Микрометод определения активности протеиназ А.П.Алексеенко. Предлагаемый микрометод определения активности протеолитических ферментов основан на из-мерении содержания аргинина в пептидах, освобождаю-щихся при гидролизе протеиназами белковых субстра-тов. Содержание аргинина определяют с помощью стаби-лизированной и усовершенствованной реакции Сакагучи (хроматограмму погружают в 0.1% раствор 8-гидроксихинолина в ацетоне, высушивают на воздухе, опрыскивают раствором 0.2 мл Br2 в 100 мл 0.5 М NaOH; аргинин и другие гуанидины дают оранжево-красные пятна, тауромицин и гликоциамин - лишь вре-менную окраску), позволяющей определить содержание аргинина в растворах трихлоруксусной кислоты после осаждения и удаления нерастворимых белков. Зная со-держание аргинина в белковом субстрате и определяя его количество в перешедших в раствор пептидах, мож-но рассчитать процент гидролиза белкового субстрата изучаемыми протеиназами. В этом состоит главное пре-имущество метода, поскольку метод Ансона не дает возможности рассчитать процент гидролиза белка, ата-куемого протеолитическими ферментами. Из всех суще-ствующих методов только метод Мура и Штейна позволя-ет определить процент гидролиза белковых субстратов, но он имеет ограниченное применение, поскольку тре-бует предварительного проведения полного кислотного гидролиза как белка-субстрата, так и образовавшихся пептидов. В предложенной методике калибровочная кри-вая строится по растворам свободного аргинина. Вве-дение в реакцию пептидов и белков в виде их биурето-вых комплексов повысило чувствительность реакции Са-кагучи с остатками аргинина и сделало ее такой же чувствительной, как и для свободного аргинина. В ка-честве белкового субстрата используют классический субстрат - гемоглобин и окисленный по Сангеру лизо-цим. Этот низкомолекулярный белок, содержащий 12.7% аргинина прекрасно расщепляется пепсином (рвется около 30 связей).
Прежде чем приступить к определению активности ферментов в изучаемых тканевых субстратах, необходи-мо:
1. Определить зависимость активности от рН и выбрать оптимальную реакцию среды для проявления активности изучаемого фермента.
2. Построить график зависимости активности фермента от времени его инкубации с субстратом. выбрать для работы те сроки инкубации, при которых сохраняется линейная зависимость между величиной активности фер-мента и временем его инкубации.
3. Определить зависимость величины активности от концентрации белка в пробе. Выбрать такие концентра-ции фермента, при которых величина активности фер-мента была бы пропорциональна его концентрации. Сле-дует учитывать, что в тканевых экстрактах и биологи-ческих жидкостях могут присутствовать ингибиторы протеолитических ферментов. При разведении пробы их концентрация снижается , а протеолитических - увели-чивается. Определяя "фактор разведения", можно одно-временно с подбором оптимальных условий для опреде-ления протеолитической активности выявить и наличие ингибитора.
4. При определении активности фермента необходимо работать при постоянной скорости ферментативной ре-акции, достигаемой при полном насыщении фермента субстратом, при так называемой максимальной скорости ферментативной реакции. В каждом отдельном случае максимальную скорость необходимо найти эксперимен-тально, измерив активность препарата при разных кон-центрациях субстрата, при постоянных концентрациях белка и времени инкубирования.
Определение активности протеиназ по белковому субстрату.
К 0.5 мл субстрата в соответствующем буферном рас-творе добавляют 0.5 мл пробы, содержащей фермент (экстракт, биологическую жидкость), инкубируют уста-новленное опытным путем время , после чего белки в пробе осаждают 5 мл 10% трихлоруксусной кислотой. Отделяют осадок центрифугированием, а надосадочную жидкость (ТХУ-центрифугат) подвергают дальнейшей об-работке. Контрольные пробы - пробы, где реактив до-бавлен в обратном порядке: к 3 мл 10% раствора ТХУ добавляют 0.5 мл раствора, содержащего фермент и 0.5 мл субстрата. Рекомендуется ставить пробу на автолиз субстрата: к 0.5 мл субстрата добавляют 0.5 мл про-кипяченного раствора, содержащего фермент, инкубиру-ют вместе с опытными пробами и осажденной ТХУ.
Определение содержания аргинина в ТХУ-центрифугантах по модифицированной реакции Сакагучи. К 0.5 мл ТХУ-центрифуганта добавляют 0.5 мл 2.5мМ раствора CuSO4 , 0.5 мл 5 Н. КОН, 0.5 мл раствора ДХН (2,4-дихлор-1-нафтол). Раствор встряхивают и вносят 0.5 мл гипобромита натрия, мгновенно возникает ярко-розовая окраска. Раствор встряхивают и через 20-30 секунд стабилизируют пробы добавлением 0.2 мл рас-твора 2-тиогликоля (чтобы предотвратить разрушение окрашенного продукта избытком гипобромита натрия. После добавления 2-тиодигликоля в пробы как опыт-ные, так и контрольные, появляется желтоватое окра-шивание за счет побочного продукта реакции между из-быточной ТХУ и гипобромита натрия. Побочный продукт также стабилизируется 2-тиодигликолем. Оптическая плотность пробы измеряется спектрофотометром при 520 нм в кювете толщиной 1 см.
Определение активности протеиназ по реакции с реактивом Фолина. К 0.5 мл того же ТХУ-центрифуганта добавляют 0.5 мл 2.5 мМ раствора CuSO4 , 4 мл 0.5 н. раствора NaOH и 1.5 мл разбавленного в три раза ре-актива Фолина. Через 30 минут измеряют на спектрофо-тометре оптическую плотность при 760 нм
Калибровочные кривые по пепсиновому гидролизату окисленного лизоцима. 30 мг окисленного лизоцима растворяют в 50 мл подкисленной воды (40 мл Н2О + 10 мл 0.3 н. раствора HСl. и к полученном раствору до-бавляют 0.5 мг пепсина. Смесь оставляют при комнат-ной температуре на сутки. По истечении этого срока инкубации препарат не дает осадка с ТХУ. Этот препа-рат используют наряду с растворами аргинина и тиро-зина в качестве стандарта для построения калибровоч-ных кривых. Приготовляют разведения с содержанием от 60 до 600 мкг/мл исходного лизоцима. В пробы вводят соответствующее опытным пробам количество ТХУ. При-готовляют также растворы свободного аргинина и тиро-зина с концентрациями от 0.04 до 0.25 мкмоль/мл. Из каждой пробы берут по 0.5 мл (в трех параллельных пробах) для определения содержания аргинина и тиро-зина по Фолину.
Калибровочные кривые. 3 получена с помощью мик-рометода на основе реакции Сакагучи (520 нм) по рас-творам аргинина (х) и по пептидному гидролизу лизо-цима (о); 1 и 2 - с помощью реакции Фолина (760 нм): 2 - по растворам тирозина, 1 - по пептидному гидро-лизу лизоцима. Значение оптической плотности
проб, измерен-ные при 520 нм или 760 нм, на-несены на гра-фик против кон-центрации арги-нина или тирозина или их остатков в пеп-синовом гидро-лизате лизоци-ма. Кривая 1, проходящая выше кривой 2, полу-чена при реак-ции реактива Фолина с рас-

Количество аминокислоты или ее остатка
в гидролизате в наномолях на 1 мл.

творами тирозина эквивалентной концентрации. Кривая 3 получена в результате реакции Сакагучи как со сво-бодным аргинином, так и с его остатками, содержащи-мися в пептидах пепсинового гидролизата лизоцима. Расположение опытных точек точно по прямой свиде-тельствует о том, что в гидролизате, осажденном ТХУ, весь аргинин полностью реагирует с реактивом Сакагу-чи.
Воздействие Фолина на тирозин не специфично. Кроме тирозина в пептидах с этим реактивом реагируют триптофан, цистеин. Образуемые медью с тетрапептида-ми и полипептидами биуретовые комплексы облегчают такое взаимодействие. Следовательно, выражение вели-чины активности протеолитических ферментов в тирози-новых эквивалентах и по Фолину, как это иногда дела-ют, неправильно.

Таким образом, мы рассмотрели особенности фер-ментов как биологических катализаторов, показаны их отличия от небелковых катализаторов, способы измере-ния активности предложенных ферментов - пепсина и папаина. К сожалению, на данный момент имеется до-вольно незначительное количество публикаций по ис-следованию папаина.